Δοκιμή μεθυλίωσης DNA σε συνδυασμό με smartphone για έγκαιρο έλεγχο όγκων και έλεγχο λευχαιμίας με ακρίβεια 90,0%!

Η πρώιμη ανίχνευση του καρκίνου με βάση την υγρή βιοψία είναι μια νέα κατεύθυνση ανίχνευσης και διάγνωσης καρκίνου που προτείνεται από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου των ΗΠΑ τα τελευταία χρόνια, με στόχο την πρώιμη ανίχνευση καρκίνου ή και προκαρκινικών βλαβών. Έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως ως νέος βιοδείκτης για την έγκαιρη διάγνωση διαφόρων κακοηθειών, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του πνεύμονα, των όγκων του γαστρεντερικού σωλήνα, των γλοιωμάτων και των γυναικολογικών όγκων.

Η εμφάνιση πλατφορμών για τον εντοπισμό βιοδεικτών τοπίου μεθυλίωσης (Methylscape) έχει τη δυνατότητα να βελτιώσει σημαντικά τον υπάρχοντα έγκαιρο προσυμπτωματικό έλεγχο για καρκίνο, θέτοντας τους ασθενείς στο πιο πρώιμο ιάσιμο στάδιο.

Πρόσφατα, οι ερευνητές ανέπτυξαν μια απλή και άμεση πλατφόρμα ανίχνευσης για την ανίχνευση του τοπίου μεθυλίωσης βασισμένη σε νανοσωματίδια χρυσού διακοσμημένα με κυστεαμίνη (Cyst/AuNPs) σε συνδυασμό με έναν βιοαισθητήρα που βασίζεται σε smartphone που επιτρέπει την ταχεία έγκαιρη εξέταση ενός ευρέος φάσματος όγκων. Ο πρώιμος έλεγχος για λευχαιμία μπορεί να πραγματοποιηθεί εντός 15 λεπτών μετά την εξαγωγή DNA από δείγμα αίματος, με ακρίβεια 90,0%. Ο τίτλος του άρθρου είναι Ταχεία ανίχνευση του DNA του καρκίνου στο ανθρώπινο αίμα χρησιμοποιώντας AuNP με κάλυψη κυστεαμίνης και ένα smartphone με δυνατότητα μηχανικής μάθησης.

Εικόνα 1. Μια απλή και γρήγορη πλατφόρμα ανίχνευσης για προσυμπτωματικό έλεγχο καρκίνου μέσω στοιχείων Cyst/AuNPs μπορεί να επιτευχθεί με δύο απλά βήματα.

Αυτό φαίνεται στο Σχήμα 1. Αρχικά, χρησιμοποιήθηκε ένα υδατικό διάλυμα για τη διάλυση των θραυσμάτων DNA. Στη συνέχεια προστέθηκαν κύστη/ΑυΝΡ στο μικτό διάλυμα. Το φυσιολογικό και το κακόηθες DNA έχουν διαφορετικές ιδιότητες μεθυλίωσης, με αποτέλεσμα θραύσματα DNA με διαφορετικά πρότυπα αυτοσυναρμολόγησης. Το κανονικό DNA συσσωματώνεται χαλαρά και τελικά συσσωματώνει Κύστη/ΑυΝΡ, γεγονός που έχει ως αποτέλεσμα τη μετατοπισμένη ερυθρά φύση των Κύστη/ΑυΝΡ, έτσι ώστε μια αλλαγή στο χρώμα από κόκκινο σε μοβ μπορεί να παρατηρηθεί με γυμνό μάτι. Αντίθετα, το μοναδικό προφίλ μεθυλίωσης του καρκινικού DNA οδηγεί στην παραγωγή μεγαλύτερων συστάδων θραυσμάτων DNA.

Εικόνες πλακών 96 φρεατίων λήφθηκαν χρησιμοποιώντας κάμερα smartphone. Το DNA του καρκίνου μετρήθηκε από ένα smartphone εξοπλισμένο με μηχανική μάθηση σε σύγκριση με μεθόδους που βασίζονται στη φασματοσκοπία.

Έλεγχος καρκίνου σε πραγματικά δείγματα αίματος

Για να επεκτείνουν τη χρησιμότητα της πλατφόρμας ανίχνευσης, οι ερευνητές εφάρμοσαν έναν αισθητήρα που διέκρινε επιτυχώς μεταξύ φυσιολογικού και καρκινικού DNA σε πραγματικά δείγματα αίματος. Τα πρότυπα μεθυλίωσης στις θέσεις CpG ρυθμίζουν επιγενετικά την έκφραση γονιδίων. Σχεδόν σε όλους τους τύπους καρκίνου, οι αλλαγές στη μεθυλίωση του DNA και συνεπώς στην έκφραση των γονιδίων που προάγουν την ογκογένεση έχει παρατηρηθεί να εναλλάσσονται.

Ως μοντέλο για άλλους καρκίνους που σχετίζονται με τη μεθυλίωση του DNA, οι ερευνητές χρησιμοποίησαν δείγματα αίματος από ασθενείς με λευχαιμία και υγιείς μάρτυρες για να διερευνήσουν την αποτελεσματικότητα του τοπίου της μεθυλίωσης στη διαφοροποίηση των λευχαιμικών καρκίνων. Αυτός ο βιοδείκτης τοπίου μεθυλίωσης όχι μόνο υπερέχει των υπαρχουσών μεθόδων προσυμπτωματικού ελέγχου ταχείας λευχαιμίας, αλλά καταδεικνύει επίσης τη δυνατότητα επέκτασης στην έγκαιρη ανίχνευση ενός ευρέος φάσματος καρκίνων χρησιμοποιώντας αυτήν την απλή και απλή ανάλυση.

Αναλύθηκε DNA από δείγματα αίματος από 31 ασθενείς με λευχαιμία και 12 υγιή άτομα. όπως φαίνεται στο διάγραμμα πλαισίου στο Σχήμα 2α, η σχετική απορρόφηση των δειγμάτων καρκίνου (ΔΑ650/525) ήταν χαμηλότερη από αυτή του DNA από κανονικά δείγματα. Αυτό οφειλόταν κυρίως στην ενισχυμένη υδροφοβικότητα που οδήγησε σε πυκνή συσσωμάτωση του DNA του καρκίνου, η οποία απέτρεψε τη συσσώρευση των Κύστη/ΑυΝΡ. Ως αποτέλεσμα, αυτά τα νανοσωματίδια διασκορπίστηκαν πλήρως στα εξωτερικά στρώματα των συσσωματωμάτων του καρκίνου, γεγονός που είχε ως αποτέλεσμα μια διαφορετική διασπορά των κύστεων/AuNPs που προσροφήθηκαν σε φυσιολογικά και καρκινικά συσσωματώματα DNA. Στη συνέχεια δημιουργήθηκαν καμπύλες ROC μεταβάλλοντας το όριο από μια ελάχιστη τιμή ΔΑ650/525 σε μια μέγιστη τιμή.

Σχήμα 2.(α) Σχετικές τιμές απορρόφησης διαλυμάτων κύστης/AuNPs που δείχνουν την παρουσία φυσιολογικού (μπλε) και καρκίνου (κόκκινο) DNA υπό βελτιστοποιημένες συνθήκες

(DA650/525) οικοπέδων κιβωτίων· (β) Ανάλυση ROC και αξιολόγηση διαγνωστικών εξετάσεων. (γ) Πίνακας σύγχυσης για τη διάγνωση φυσιολογικών και καρκινοπαθών ασθενών. (δ) Ευαισθησία, ειδικότητα, θετική προγνωστική αξία (PPV), αρνητική προγνωστική αξία (NPV) και ακρίβεια της μεθόδου που αναπτύχθηκε.

Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2β, η περιοχή κάτω από την καμπύλη ROC (AUC = 0,9274) που λήφθηκε για τον ανεπτυγμένο αισθητήρα έδειξε υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα. Όπως φαίνεται από το διάγραμμα πλαισίου, το χαμηλότερο σημείο που αντιπροσωπεύει την κανονική ομάδα DNA δεν είναι καλά διαχωρισμένο από το υψηλότερο σημείο που αντιπροσωπεύει την ομάδα DNA του καρκίνου. Ως εκ τούτου, χρησιμοποιήθηκε λογιστική παλινδρόμηση για τη διαφοροποίηση μεταξύ της φυσιολογικής και της καρκινικής ομάδας. Δεδομένου ενός συνόλου ανεξάρτητων μεταβλητών, εκτιμά την πιθανότητα να συμβεί ένα συμβάν, όπως ένας καρκίνος ή μια φυσιολογική ομάδα. Η εξαρτημένη μεταβλητή κυμαίνεται μεταξύ 0 και 1. Το αποτέλεσμα είναι επομένως μια πιθανότητα. Προσδιορίσαμε την πιθανότητα ταυτοποίησης του καρκίνου (P) με βάση το ΔΑ650/525 ως εξής.

όπου b=5,3533,w1=-6,965. Για την ταξινόμηση του δείγματος, μια πιθανότητα μικρότερη από 0,5 υποδηλώνει ένα φυσιολογικό δείγμα, ενώ μια πιθανότητα 0,5 ή μεγαλύτερη υποδηλώνει δείγμα καρκίνου. Το σχήμα 2γ απεικονίζει τον πίνακα σύγχυσης που δημιουργήθηκε από τη διασταυρούμενη επικύρωση αφήστε το μόνο του, ο οποίος χρησιμοποιήθηκε για την επικύρωση της σταθερότητας της μεθόδου ταξινόμησης. Το Σχήμα 2δ συνοψίζει την αξιολόγηση της διαγνωστικής δοκιμής της μεθόδου, συμπεριλαμβανομένης της ευαισθησίας, της ειδικότητας, της θετικής προγνωστικής αξίας (PPV) και της αρνητικής προγνωστικής αξίας (NPV).

Βιοαισθητήρες που βασίζονται σε smartphone

Για να απλοποιήσουν περαιτέρω τη δοκιμή δειγμάτων χωρίς τη χρήση φασματοφωτόμετρων, οι ερευνητές χρησιμοποίησαν τεχνητή νοημοσύνη (AI) για να ερμηνεύσουν το χρώμα του διαλύματος και να διακρίνουν μεταξύ φυσιολογικών και καρκινικών ατόμων. Δεδομένου αυτού, η όραση υπολογιστή χρησιμοποιήθηκε για να μεταφράσει το χρώμα του διαλύματος Cyst/AuNPs σε κανονικό DNA (μωβ) ή καρκινικό DNA (κόκκινο) χρησιμοποιώντας εικόνες πλακών 96 φρεατίων που ελήφθησαν μέσω κάμερας κινητού τηλεφώνου. Η τεχνητή νοημοσύνη μπορεί να μειώσει το κόστος και να βελτιώσει την προσβασιμότητα στην ερμηνεία του χρώματος των λύσεων νανοσωματιδίων και χωρίς τη χρήση αξεσουάρ smartphone οπτικού υλικού. Τέλος, δύο μοντέλα μηχανικής μάθησης, συμπεριλαμβανομένων των Random Forest (RF) και Support Vector Machine (SVM) εκπαιδεύτηκαν για την κατασκευή των μοντέλων. Και τα δύο μοντέλα RF και SVM ταξινόμησαν σωστά τα δείγματα ως θετικά και αρνητικά με ακρίβεια 90,0%. Αυτό υποδηλώνει ότι η χρήση της τεχνητής νοημοσύνης στον βιοαισθητήρα που βασίζεται σε κινητά τηλέφωνα είναι αρκετά πιθανή.

Εικόνα 3.(α) Κατηγορία στόχου του διαλύματος που καταγράφηκε κατά την προετοιμασία του δείγματος για το βήμα λήψης εικόνας. (β) Παράδειγμα εικόνας που λήφθηκε κατά το βήμα λήψης εικόνας. (γ) Ένταση χρώματος του διαλύματος κύστης/AuNPs σε κάθε φρεάτιο της πλάκας 96 φρεατίων που εξάγεται από την εικόνα (β).

Χρησιμοποιώντας Cyst/AuNPs, οι ερευνητές ανέπτυξαν με επιτυχία μια απλή πλατφόρμα ανίχνευσης για ανίχνευση τοπίου μεθυλίωσης και έναν αισθητήρα ικανό να διακρίνει το φυσιολογικό DNA από το καρκινικό DNA όταν χρησιμοποιούν πραγματικά δείγματα αίματος για τον έλεγχο λευχαιμίας. Ο αισθητήρας που αναπτύχθηκε έδειξε ότι το DNA που εξήχθη από πραγματικά δείγματα αίματος ήταν σε θέση να ανιχνεύσει γρήγορα και οικονομικά μικρές ποσότητες καρκινικού DNA (3nM) σε ασθενείς με λευχαιμία σε 15 λεπτά και έδειξε ακρίβεια 95,3%. Για την περαιτέρω απλούστευση της δοκιμής δειγμάτων εξαλείφοντας την ανάγκη για φασματοφωτόμετρο, χρησιμοποιήθηκε μηχανική μάθηση για την ερμηνεία του χρώματος του διαλύματος και τη διαφοροποίηση μεταξύ φυσιολογικών και καρκινικών ατόμων χρησιμοποιώντας φωτογραφία κινητού τηλεφώνου, ενώ η ακρίβεια επιτεύχθηκε επίσης στο 90,0%.

Αναφορά: DOI: 10.1039/d2ra05725e