Δοκιμές μεθυλίωσης DNA σε συνδυασμό με smartphones για την πρόωρη εξέταση των όγκων και την εξέταση λευχαιμίας με ακρίβεια 90,0%!

Η έγκαιρη ανίχνευση του καρκίνου που βασίζεται στην υγρή βιοψία είναι μια νέα κατεύθυνση ανίχνευσης και διάγνωσης του καρκίνου που προτείνεται από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου των ΗΠΑ τα τελευταία χρόνια, με σκοπό την ανίχνευση του πρώιμου καρκίνου ή ακόμα και των προκαρκινικών αλλοιώσεων. Έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως ως νέος βιοδείκτης για την έγκαιρη διάγνωση διαφόρων κακοηθειών, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του πνεύμονα, των γαστρεντερικών όγκων, των γλοιωμάτων και των γυναικολογικών όγκων.

Η εμφάνιση πλατφορμών για τον εντοπισμό βιοδεικτών μεθυλίωσης τοπίου (μεθυλοσκώθος) έχει τη δυνατότητα να βελτιώσει σημαντικά την υπάρχουσα πρόωρη εξέταση για τον καρκίνο, τοποθετώντας τους ασθενείς στο παλαιότερο θεραπευτικό στάδιο.

Πρόσφατα, οι ερευνητές έχουν αναπτύξει μια απλή και άμεση πλατφόρμα ανίχνευσης για την ανίχνευση τοπίου μεθυλίωσης με βάση τα νανοσωματίδια χρυσού κυστεαμίνης (κύστεις/AUNPs) σε συνδυασμό με έναν βιοαισθητήρα που βασίζεται σε smartphone που επιτρέπει την ταχεία πρόωρη διαλογή ενός ευρέος φάσματος όγκων. Η πρόωρη προβολή για λευχαιμία μπορεί να πραγματοποιηθεί εντός 15 λεπτών μετά την εκχύλιση DNA από δείγμα αίματος, με ακρίβεια 90,0%. Ο τίτλος του άρθρου είναι η ταχεία ανίχνευση του DNA του καρκίνου στο ανθρώπινο αίμα χρησιμοποιώντας AUNPs με κυστεαμίνη και ένα smartphone με δυνατότητα εκμάθησης μηχανών。

Εικόνα 1. Μια απλή και γρήγορη πλατφόρμα ανίχνευσης για τον έλεγχο του καρκίνου μέσω των στοιχείων κύστη/AUNPS μπορεί να επιτευχθεί σε δύο απλά βήματα.

Αυτό φαίνεται στο σχήμα 1. Πρώτον, χρησιμοποιήθηκε ένα υδατικό διάλυμα για τη διάλυση των θραυσμάτων του DNA. Στη συνέχεια προστέθηκαν κύστεις/AUNPs στο μικτό διάλυμα. Τα φυσιολογικά και κακοήθη ϋΝΑ έχουν διαφορετικές ιδιότητες μεθυλίωσης, με αποτέλεσμα θραύσματα DNA με διαφορετικά πρότυπα αυτοσυναρμολόγησης. Το φυσιολογικό ϋΝΑ συσσωματώνεται χαλαρά και τελικά συγκεντρώνει κύστη/AUNPs, με αποτέλεσμα την κόκκινη μετατοπισμένη φύση των κυττάρων/AUNPs, έτσι ώστε να παρατηρηθεί μια αλλαγή στο χρώμα από κόκκινο σε μοβ να παρατηρείται με γυμνό μάτι. Αντίθετα, το μοναδικό προφίλ μεθυλίωσης του DNA του καρκίνου οδηγεί στην παραγωγή μεγαλύτερων συστάδων θραυσμάτων DNA.

Εικόνες από πλάκες 96 φρεατίων λήφθηκαν χρησιμοποιώντας μια κάμερα smartphone. Το DNA του καρκίνου μετρήθηκε με ένα smartphone εξοπλισμένο με μηχανική μάθηση σε σύγκριση με μεθόδους που βασίζονται σε φασματοσκοπία.

Έλεγχος καρκίνου σε δείγματα πραγματικού αίματος

Για να επεκταθεί η χρησιμότητα της πλατφόρμας ανίχνευσης, οι ερευνητές εφάρμοσαν έναν αισθητήρα που διακρίθηκε με επιτυχία μεταξύ του φυσιολογικού και του καρκινικού DNA σε δείγματα πραγματικού αίματος. Τα πρότυπα μεθυλίωσης σε θέσεις CPG ρυθμίζουν επιγενετικά την έκφραση των γονιδίων. Σε όλους σχεδόν τους τύπους καρκίνου, παρατηρήθηκαν μεταβολές στη μεθυλίωση του DNA και επομένως στην έκφραση γονιδίων που προάγουν την ογνογεγενένεση έχουν παρατηρηθεί σε εναλλακτική.

Ως μοντέλο για άλλους καρκίνους που σχετίζονται με μεθυλίωση του DNA, οι ερευνητές χρησιμοποίησαν δείγματα αίματος από ασθενείς με λευχαιμία και υγιείς μάρτυρες για να διερευνήσουν την αποτελεσματικότητα του τοπίου μεθυλίωσης στη διαφοροποίηση των λευχαιμικών καρκίνων. Αυτός ο βιοδείκτης τοπίου μεθυλίωσης δεν υπερβαίνει μόνο τις υπάρχουσες μεθόδους εξέτασης ταχείας λευχαιμίας, αλλά αποδεικνύει επίσης τη σκοπιμότητα επέκτασης στην έγκαιρη ανίχνευση ενός ευρέος φάσματος καρκίνων χρησιμοποιώντας αυτή την απλή και απλή δοκιμασία.

Το DNA από δείγματα αίματος από 31 ασθενείς με λευχαιμία και 12 υγιή άτομα αναλύθηκε. Όπως φαίνεται στην γραφική παράσταση του κιβωτίου στο σχήμα 2Α, η σχετική απορρόφηση των δειγμάτων καρκίνου (ΔΑ650/525) ήταν χαμηλότερη από αυτή του DNA από φυσιολογικά δείγματα. Αυτό οφείλεται κυρίως στην ενισχυμένη υδροφοβικότητα που οδήγησε σε πυκνή συσσωμάτωση του DNA του καρκίνου, γεγονός που εμπόδισε τη συσσωμάτωση των κύστη/AUNPs. Ως αποτέλεσμα, αυτά τα νανοσωματίδια διασκορπίστηκαν πλήρως στα εξωτερικά στρώματα των συσσωματωμάτων του καρκίνου, τα οποία οδήγησαν σε διαφορετική διασπορά της κύστης/AUNPs που προσροφάται σε φυσιολογικά και καρκίνο DNA συσσωματώματα. Στη συνέχεια δημιουργήθηκαν καμπύλες ROC μεταβάλλοντας το κατώφλι από μια ελάχιστη τιμή ΔΑ650/525 σε μέγιστη τιμή.

Σχήμα 2. (α) Σχετικές τιμές απορρόφησης των διαλυμάτων Cyst/AuNPS που δείχνουν την παρουσία φυσιολογικού (μπλε) και καρκίνου (κόκκινου) DNA υπό βελτιστοποιημένες συνθήκες

(DA650/525) κιβωτίων. (β) Ανάλυση ROC και αξιολόγηση διαγνωστικών δοκιμών. (γ) Matrix σύγχυσης για τη διάγνωση φυσιολογικών και καρκινικών ασθενών. (δ) ευαισθησία, εξειδίκευση, θετική προγνωστική αξία (PPV), αρνητική προγνωστική αξία (NPV) και ακρίβεια της μεθόδου που έχει αναπτυχθεί.

Όπως φαίνεται στο σχήμα 2Β, η περιοχή κάτω από την καμπύλη ROC (AUC = 0.9274) που ελήφθη για τον ανεπτυγμένο αισθητήρα έδειξε υψηλή ευαισθησία και εξειδίκευση. Όπως φαίνεται από το οικόπεδο του κουτιού, το χαμηλότερο σημείο που αντιπροσωπεύει την κανονική ομάδα DNA δεν διαχωρίζεται καλά από το υψηλότερο σημείο που αντιπροσωπεύει την ομάδα DNA του καρκίνου. Ως εκ τούτου, χρησιμοποιήθηκε λογική παλινδρόμηση για τη διαφοροποίηση μεταξύ των κανονικών και των ομάδων καρκίνου. Λαμβάνοντας υπόψη ένα σύνολο ανεξάρτητων μεταβλητών, εκτιμά την πιθανότητα ενός συμβάντος που συμβαίνει, όπως ένας καρκίνος ή κανονική ομάδα. Η εξαρτημένη μεταβλητή κυμαίνεται μεταξύ 0 και 1. Το αποτέλεσμα είναι επομένως μια πιθανότητα. Προσδιορίσαμε την πιθανότητα αναγνώρισης του καρκίνου (P) με βάση το ΔΑ650/525 ως εξής.

όπου Β = 5.3533, W1 = -6.965. Για την ταξινόμηση των δειγμάτων, η πιθανότητα μικρότερη από 0,5 δείχνει ένα κανονικό δείγμα, ενώ η πιθανότητα 0,5 ή υψηλότερη δείχνει ένα δείγμα καρκίνου. Το Σχήμα 2C απεικονίζει τη μήτρα σύγχυσης που παράγεται από τη διασταυρούμενη επικύρωση άδειας-IT-alone, η οποία χρησιμοποιήθηκε για την επικύρωση της σταθερότητας της μεθόδου ταξινόμησης. Το σχήμα 2D συνοψίζει τη διαγνωστική αξιολόγηση της δοκιμής της μεθόδου, συμπεριλαμβανομένης της ευαισθησίας, της εξειδίκευσης, της θετικής προγνωστικής τιμής (PPV) και της αρνητικής προγνωστικής τιμής (NPV).

Βιοαισθητήρες που βασίζονται σε smartphone

Για να απλοποιήσει περαιτέρω τις δοκιμές δείγματος χωρίς τη χρήση φασματοφωτομέτρων, οι ερευνητές χρησιμοποίησαν τεχνητή νοημοσύνη (AI) για να ερμηνεύσουν το χρώμα της λύσης και να διακρίνουν μεταξύ φυσιολογικών και καρκινικών ατόμων. Με δεδομένο αυτό, το όραμα του υπολογιστή χρησιμοποιήθηκε για να μεταφραστεί το χρώμα του διαλύματος κύστη/AuNPS σε φυσιολογικό DNA (μοβ) ή καρκινικό DNA (κόκκινο) χρησιμοποιώντας εικόνες πλάκες 96 φρεατίων που λαμβάνονται μέσω κάμερας κινητού τηλεφώνου. Η τεχνητή νοημοσύνη μπορεί να μειώσει το κόστος και να βελτιώσει την προσβασιμότητα στην ερμηνεία του χρώματος των λύσεων νανοσωματιδίων και χωρίς τη χρήση οποιουδήποτε οπτικού υλικού smartphone αξεσουάρ. Τέλος, δύο μοντέλα μηχανικής μάθησης, συμπεριλαμβανομένων των τυχαίων δασών (RF) και της μηχανής φορέα υποστήριξης (SVM) εκπαιδεύτηκαν για την κατασκευή των μοντέλων. Τόσο τα μοντέλα RF όσο και SVM ταξινομούν σωστά τα δείγματα ως θετικά και αρνητικά με ακρίβεια 90,0%. Αυτό υποδηλώνει ότι η χρήση της τεχνητής νοημοσύνης στη βιοαισθητήρα που βασίζεται σε κινητά τηλέφωνα είναι αρκετά δυνατή.

Εικόνα 3. (α) Κλάση στόχου της λύσης που καταγράφηκε κατά την παρασκευή του δείγματος για το βήμα απόκτησης εικόνας. (β) Παράδειγμα εικόνας που λαμβάνεται κατά τη διάρκεια του βήματος απόκτησης εικόνας. (γ) Ένταση χρώματος του διαλύματος κύστη/AUNPS σε κάθε φρεάτιο της πλάκας 96 φρεατίων που εξάγεται από την εικόνα (Β).

Χρησιμοποιώντας κύστεις/AUNPs, οι ερευνητές έχουν αναπτύξει με επιτυχία μια απλή πλατφόρμα ανίχνευσης για την ανίχνευση τοπίου μεθυλίωσης και έναν αισθητήρα ικανό να διακρίνει το φυσιολογικό DNA από το DNA του καρκίνου όταν χρησιμοποιεί δείγματα πραγματικού αίματος για διαλογή λευχαιμίας. Ο αναπτυγμένος αισθητήρας έδειξε ότι το DNA που εξάγεται από πραγματικά δείγματα αίματος ήταν σε θέση να ανιχνεύσει γρήγορα και οικονομικά αποτελεσματικά τις μικρές ποσότητες DNA του καρκίνου (3nm) σε ασθενείς με λευχαιμία σε 15 λεπτά και έδειξε ακρίβεια 95,3%. Για να απλοποιηθεί περαιτέρω οι δοκιμές δείγματος εξαλείφοντας την ανάγκη για φασματοφωτόμετρο, χρησιμοποιήθηκε η μηχανική μάθηση για την ερμηνεία του χρώματος της λύσης και τη διαφοροποίηση μεταξύ φυσιολογικών και καρκινικών ατόμων που χρησιμοποιούν μια φωτογραφία κινητής τηλεφωνίας και η ακρίβεια ήταν επίσης σε θέση να επιτευχθεί στο 90,0%.

Αναφορά: doi: 10.1039/d2ra05725e