Δοκιμή μεθυλίωσης DNA σε συνδυασμό με smartphones για έγκαιρο έλεγχο όγκων και λευχαιμίας με ακρίβεια 90,0%!

Η έγκαιρη ανίχνευση του καρκίνου με βάση την υγρή βιοψία είναι μια νέα κατεύθυνση ανίχνευσης και διάγνωσης του καρκίνου που έχει προταθεί από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου των ΗΠΑ τα τελευταία χρόνια, με στόχο την ανίχνευση πρώιμου καρκίνου ή ακόμη και προκαρκινικών αλλοιώσεων. Έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως ως νέος βιοδείκτης για την έγκαιρη διάγνωση διαφόρων κακοηθειών, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του πνεύμονα, των γαστρεντερικών όγκων, των γλοιωμάτων και των γυναικολογικών όγκων.

Η εμφάνιση πλατφορμών για τον εντοπισμό βιοδεικτών τοπίου μεθυλίωσης (Methylscape) έχει τη δυνατότητα να βελτιώσει σημαντικά τον υπάρχοντα έγκαιρο έλεγχο για τον καρκίνο, τοποθετώντας τους ασθενείς στο πρώιμο θεραπεύσιμο στάδιο.

Πρόσφατα, οι ερευνητές ανέπτυξαν μια απλή και άμεση πλατφόρμα ανίχνευσης για την ανίχνευση τοπίου μεθυλίωσης, βασισμένη σε νανοσωματίδια χρυσού διακοσμημένα με κυστεαμίνη (Cyst/AuNPs), σε συνδυασμό με έναν βιοαισθητήρα που βασίζεται σε smartphone, ο οποίος επιτρέπει τον ταχύ πρώιμο έλεγχο ενός ευρέος φάσματος όγκων. Ο πρώιμος έλεγχος για λευχαιμία μπορεί να πραγματοποιηθεί εντός 15 λεπτών μετά την εξαγωγή DNA από ένα δείγμα αίματος, με ακρίβεια 90,0%. Ο τίτλος του άρθρου είναι: Ταχεία ανίχνευση καρκινικού DNA σε ανθρώπινο αίμα χρησιμοποιώντας AuNPs με επικάλυψη κυστεαμίνης και ένα smartphone με δυνατότητα μηχανικής μάθησης.

Σχήμα 1. Μια απλή και γρήγορη πλατφόρμα ανίχνευσης για τον έλεγχο καρκίνου μέσω συστατικών Cyst/AuNPs μπορεί να επιτευχθεί σε δύο απλά βήματα.

Αυτό φαίνεται στο Σχήμα 1. Αρχικά, χρησιμοποιήθηκε ένα υδατικό διάλυμα για τη διάλυση των θραυσμάτων DNA. Στη συνέχεια, προστέθηκαν στο μεικτό διάλυμα κύστες/νανοσοκομειακές νανοσωματίδες (Cyst/AuNPs). Το φυσιολογικό και το κακοήθη DNA έχουν διαφορετικές ιδιότητες μεθυλίωσης, με αποτέλεσμα θραύσματα DNA με διαφορετικά πρότυπα αυτοσυναρμολόγησης. Το φυσιολογικό DNA συσσωματώνεται χαλαρά και τελικά συσσωματώνει κύστεις/νανοσοκομειακές νανοσωματίδες (Cyst/AuNPs), με αποτέλεσμα τη μετατόπιση προς το κόκκινο των νανοσοκομειακών νανοσωματιδίων (Cyst/AuNPs), έτσι ώστε να μπορεί να παρατηρηθεί μια αλλαγή στο χρώμα από κόκκινο σε μοβ με γυμνό μάτι. Αντίθετα, το μοναδικό προφίλ μεθυλίωσης του καρκινικού DNA οδηγεί στην παραγωγή μεγαλύτερων συστάδων θραυσμάτων DNA.

Εικόνες πλακών 96 φρεατίων λήφθηκαν χρησιμοποιώντας κάμερα smartphone. Το καρκινικό DNA μετρήθηκε με smartphone εξοπλισμένο με μηχανική μάθηση σε σύγκριση με μεθόδους που βασίζονται στη φασματοσκοπία.

Έλεγχος καρκίνου σε πραγματικά δείγματα αίματος

Για να επεκτείνουν τη χρησιμότητα της πλατφόρμας ανίχνευσης, οι ερευνητές εφάρμοσαν έναν αισθητήρα που διέκρινε με επιτυχία μεταξύ φυσιολογικού και καρκινικού DNA σε πραγματικά δείγματα αίματος. Τα πρότυπα μεθυλίωσης στις θέσεις CpG ρυθμίζουν επιγενετικά την γονιδιακή έκφραση. Σε σχεδόν όλους τους τύπους καρκίνου, έχουν παρατηρηθεί εναλλαγές στη μεθυλίωση του DNA και, κατά συνέπεια, στην έκφραση γονιδίων που προάγουν την καρκινογένεση.

Ως μοντέλο για άλλους καρκίνους που σχετίζονται με τη μεθυλίωση του DNA, οι ερευνητές χρησιμοποίησαν δείγματα αίματος από ασθενείς με λευχαιμία και υγιείς μάρτυρες για να διερευνήσουν την αποτελεσματικότητα του τοπίου μεθυλίωσης στη διαφοροποίηση των λευχαιμικών καρκίνων. Αυτός ο βιοδείκτης τοπίου μεθυλίωσης όχι μόνο ξεπερνά τις υπάρχουσες μεθόδους ταχείας ανίχνευσης λευχαιμίας, αλλά καταδεικνύει επίσης τη δυνατότητα επέκτασης στην έγκαιρη ανίχνευση ενός ευρέος φάσματος καρκίνων χρησιμοποιώντας αυτήν την απλή και απλή δοκιμασία.

Αναλύθηκε DNA από δείγματα αίματος από 31 ασθενείς με λευχαιμία και 12 υγιή άτομα. Όπως φαίνεται στο διάγραμμα πλαισίου στο Σχήμα 2α, η σχετική απορρόφηση των δειγμάτων καρκίνου (ΔA650/525) ήταν χαμηλότερη από αυτή του DNA από φυσιολογικά δείγματα. Αυτό οφειλόταν κυρίως στην αυξημένη υδροφοβικότητα που οδήγησε σε πυκνή συσσωμάτωση του καρκινικού DNA, η οποία εμπόδισε τη συσσωμάτωση των Cyst/AuNPs. Ως αποτέλεσμα, αυτά τα νανοσωματίδια διασκορπίστηκαν πλήρως στα εξωτερικά στρώματα των καρκινικών συσσωματωμάτων, γεγονός που οδήγησε σε διαφορετική διασπορά των Cyst/AuNPs που προσροφήθηκαν σε φυσιολογικά και καρκινικά συσσωματώματα DNA. Στη συνέχεια, δημιουργήθηκαν καμπύλες ROC μεταβάλλοντας το κατώφλι από μια ελάχιστη τιμή ΔA650/525 σε μια μέγιστη τιμή.

Σχήμα 2.(α) Σχετικές τιμές απορρόφησης διαλυμάτων κύστης/AuNPs που δείχνουν την παρουσία φυσιολογικού (μπλε) και καρκινικού (κόκκινου) DNA υπό βελτιστοποιημένες συνθήκες

(DA650/525) box pages (διαγραμμάτων κουτιού)· (β) Ανάλυση ROC και αξιολόγηση διαγνωστικών εξετάσεων. (γ) Πίνακας σύγχυσης για τη διάγνωση φυσιολογικών και καρκινοπαθών ασθενών. (δ) Ευαισθησία, ειδικότητα, θετική προγνωστική αξία (PPV), αρνητική προγνωστική αξία (NPV) και ακρίβεια της αναπτυγμένης μεθόδου.

Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2β, η περιοχή κάτω από την καμπύλη ROC (AUC = 0,9274) που ελήφθη για τον ανεπτυγμένο αισθητήρα έδειξε υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα. Όπως φαίνεται από το διάγραμμα πλαισίου, το χαμηλότερο σημείο που αντιπροσωπεύει την ομάδα φυσιολογικού DNA δεν είναι καλά διαχωρισμένο από το υψηλότερο σημείο που αντιπροσωπεύει την ομάδα DNA του καρκίνου. Συνεπώς, χρησιμοποιήθηκε λογιστική παλινδρόμηση για τη διαφοροποίηση μεταξύ των φυσιολογικών και των καρκινικών ομάδων. Δεδομένου ενός συνόλου ανεξάρτητων μεταβλητών, εκτιμάται η πιθανότητα εμφάνισης ενός συμβάντος, όπως μια ομάδα καρκίνου ή μια φυσιολογική ομάδα. Η εξαρτημένη μεταβλητή κυμαίνεται μεταξύ 0 και 1. Το αποτέλεσμα είναι επομένως μια πιθανότητα. Προσδιορίσαμε την πιθανότητα ταυτοποίησης του καρκίνου (P) με βάση το ΔA650/525 ως εξής.

όπου b=5,3533, w1=-6,965. Για την ταξινόμηση δείγματος, πιθανότητα μικρότερη από 0,5 υποδεικνύει φυσιολογικό δείγμα, ενώ πιθανότητα 0,5 ή υψηλότερη υποδεικνύει δείγμα καρκίνου. Το Σχήμα 2γ απεικονίζει τον πίνακα σύγχυσης που δημιουργήθηκε από την διασταυρούμενη επικύρωση χωρίς παρέμβαση, η οποία χρησιμοποιήθηκε για την επικύρωση της σταθερότητας της μεθόδου ταξινόμησης. Το Σχήμα 2δ συνοψίζει την αξιολόγηση των διαγνωστικών δοκιμών της μεθόδου, συμπεριλαμβανομένης της ευαισθησίας, της ειδικότητας, της θετικής προγνωστικής αξίας (PPV) και της αρνητικής προγνωστικής αξίας (NPV).

Βιοαισθητήρες που βασίζονται σε smartphone

Για να απλοποιήσουν περαιτέρω τις δοκιμές δειγμάτων χωρίς τη χρήση φασματοφωτομέτρων, οι ερευνητές χρησιμοποίησαν τεχνητή νοημοσύνη (AI) για να ερμηνεύσουν το χρώμα του διαλύματος και να διακρίνουν μεταξύ φυσιολογικών και καρκινικών ατόμων. Δεδομένου αυτού, χρησιμοποιήθηκε η υπολογιστική όραση για να μεταφραστεί το χρώμα του διαλύματος Cyst/AuNPs σε φυσιολογικό DNA (μωβ) ή καρκινικό DNA (κόκκινο) χρησιμοποιώντας εικόνες πλακών 96 φρεατίων που λήφθηκαν μέσω κάμερας κινητού τηλεφώνου. Η τεχνητή νοημοσύνη μπορεί να μειώσει το κόστος και να βελτιώσει την προσβασιμότητα στην ερμηνεία του χρώματος των διαλυμάτων νανοσωματιδίων, και χωρίς τη χρήση οποιουδήποτε οπτικού εξαρτήματος smartphone. Τέλος, δύο μοντέλα μηχανικής μάθησης, συμπεριλαμβανομένων των Random Forest (RF) και Support Vector Machine (SVM), εκπαιδεύτηκαν για την κατασκευή των μοντέλων. Τόσο τα μοντέλα RF όσο και τα μοντέλα SVM ταξινόμησαν σωστά τα δείγματα ως θετικά και αρνητικά με ακρίβεια 90,0%. Αυτό υποδηλώνει ότι η χρήση τεχνητής νοημοσύνης στη βιοανίχνευση που βασίζεται σε κινητά τηλέφωνα είναι αρκετά πιθανή.

Σχήμα 3.(α) Κατηγορία-στόχος του διαλύματος που καταγράφηκε κατά την προετοιμασία του δείγματος για το βήμα λήψης εικόνας. (β) Παράδειγμα εικόνας που λήφθηκε κατά το βήμα λήψης εικόνας. (γ) Ένταση χρώματος του διαλύματος κύστης/AuNPs σε κάθε φρεάτιο της πλάκας 96 φρεατίων που εξήχθη από την εικόνα (β).

Χρησιμοποιώντας Cyst/AuNPs, οι ερευνητές ανέπτυξαν με επιτυχία μια απλή πλατφόρμα ανίχνευσης για την ανίχνευση τοπίου μεθυλίωσης και έναν αισθητήρα ικανό να διακρίνει το φυσιολογικό DNA από το καρκινικό DNA όταν χρησιμοποιούνται πραγματικά δείγματα αίματος για τον έλεγχο λευχαιμίας. Ο αναπτυγμένος αισθητήρας απέδειξε ότι το DNA που εξάγεται από πραγματικά δείγματα αίματος ήταν σε θέση να ανιχνεύει γρήγορα και οικονομικά μικρές ποσότητες καρκινικού DNA (3nM) σε ασθενείς με λευχαιμία σε 15 λεπτά και έδειξε ακρίβεια 95,3%. Για την περαιτέρω απλοποίηση της δοκιμής δειγμάτων εξαλείφοντας την ανάγκη για φασματοφωτόμετρο, χρησιμοποιήθηκε μηχανική μάθηση για την ερμηνεία του χρώματος του διαλύματος και τη διαφοροποίηση μεταξύ φυσιολογικών και καρκινικών ατόμων χρησιμοποιώντας φωτογραφία από κινητό τηλέφωνο, και η ακρίβεια επιτεύχθηκε επίσης στο 90,0%.

Αναφορά: DOI: 10.1039/d2ra05725e