Παράγοντες παρεμβολής στις αντιδράσεις PCR

Κατά τη διάρκεια της αντίδρασης PCR, συχνά συναντώνται ορισμένοι παρεμβαλλόμενοι παράγοντες.
Λόγω της πολύ υψηλής ευαισθησίας της PCR, η μόλυνση θεωρείται ένας από τους σημαντικότερους παράγοντες που επηρεάζουν τα αποτελέσματα της PCR και μπορεί να δώσει ψευδώς θετικά αποτελέσματα.
Εξίσου κρίσιμες είναι οι διάφορες πηγές που οδηγούν σε ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα. Εάν ένα ή περισσότερα βασικά μέρη του μείγματος PCR ή η ίδια η αντίδραση ενίσχυσης ανασταλούν ή επηρεαστούν, η διαγνωστική δοκιμασία μπορεί να παρεμποδιστεί. Αυτό μπορεί να οδηγήσει σε μειωμένη αποτελεσματικότητα και ακόμη και σε ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα.
Εκτός από την αναστολή, μπορεί να προκληθεί απώλεια της ακεραιότητας του νουκλεϊκού οξέος-στόχου λόγω των συνθηκών αποστολής ή/και αποθήκευσης πριν από την προετοιμασία του δείγματος. Συγκεκριμένα, οι υψηλές θερμοκρασίες ή η ανεπαρκής αποθήκευση μπορεί να οδηγήσουν σε βλάβη των κυττάρων και των νουκλεϊκών οξέων. Η στερέωση κυττάρων και ιστών και η ενσωμάτωση σε παραφίνη είναι γνωστές αιτίες κατακερματισμού του DNA και ένα επίμονο πρόβλημα (βλ. Σχήματα 1 και 2). Σε αυτές τις περιπτώσεις, ακόμη και η βέλτιστη απομόνωση και καθαρισμός δεν θα βοηθήσουν.

Σχήμα 1 | Επίδραση της ακινητοποίησης στην ακεραιότητα του DNA
Η ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης έδειξε ότι η ποιότητα του DNA που απομονώθηκε από τομές παραφίνης νεκροψιών ποικίλλει σημαντικά. DNA διαφορετικού μέσου μήκους θραυσμάτων υπήρχε στα εκχυλίσματα ανάλογα με τη μέθοδο στερέωσης. Το DNA διατηρήθηκε μόνο όταν σταθεροποιήθηκε σε φυσικά κατεψυγμένα δείγματα και σε ουδέτερη φορμόλη με ρυθμιστικό διάλυμα. Η χρήση ενός ισχυρά όξινου σταθεροποιητικού Bouin ή μη ρυθμισμένης φορμόλης που περιείχε μυρμηκικό οξύ είχε ως αποτέλεσμα σημαντική απώλεια DNA. Το υπόλοιπο κλάσμα είναι ιδιαίτερα κατακερματισμένο.
Στα αριστερά, το μήκος των θραυσμάτων εκφράζεται σε ζεύγη κιλοβάσεων (kbp)

Σχήμα 2 | Απώλεια ακεραιότητας των στόχων νουκλεϊκού οξέος
(α) Ένα κενό 3′-5′ και στις δύο αλυσίδες θα οδηγήσει σε ρήξη του DNA-στόχου. Η σύνθεση DNA θα εξακολουθεί να συμβαίνει στο μικρό θραύσμα. Ωστόσο, εάν λείπει μια θέση ανόπτησης εκκινητή στο θραύσμα DNA, λαμβάνει χώρα μόνο γραμμική ενίσχυση. Στην πιο ευνοϊκή περίπτωση, τα θραύσματα μπορεί να επανακορεστούν μεταξύ τους, αλλά οι αποδόσεις θα είναι μικρές και κάτω από τα επίπεδα ανίχνευσης.
(β) Η απώλεια βάσεων, κυρίως λόγω αποπουρίνωσης και σχηματισμού διμερούς θυμιδίνης, οδηγεί σε μείωση του αριθμού των δεσμών Η και σε μείωση της Tm. Κατά τη διάρκεια της επιμήκους φάσης θέρμανσης, οι εκκινητές θα λιώσουν και θα απομακρυνθούν από το DNA της μήτρας και δεν θα υποστούν ανόπτηση ακόμη και υπό λιγότερο αυστηρές συνθήκες.
(γ) Οι γειτονικές βάσεις θυμίνης σχηματίζουν ένα διμερές TT.
Ένα άλλο συνηθισμένο πρόβλημα που εμφανίζεται συχνά στη μοριακή διαγνωστική είναι η λιγότερο από τη βέλτιστη απελευθέρωση νουκλεϊκών οξέων-στόχων σε σύγκριση με την εκχύλιση με φαινόλη-χλωροφόρμιο. Σε ακραίες περιπτώσεις, αυτό μπορεί να συσχετιστεί με ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα. Πολύς χρόνος μπορεί να εξοικονομηθεί με τη λύση με βρασμό ή την ενζυμική πέψη των κυτταρικών υπολειμμάτων, αλλά αυτή η μέθοδος συχνά οδηγεί σε χαμηλή ευαισθησία PCR λόγω ανεπαρκούς απελευθέρωσης νουκλεϊκών οξέων.

Αναστολή της δραστικότητας της πολυμεράσης κατά την ενίσχυση

Γενικά, η αναστολή χρησιμοποιείται ως έννοια περιέκτη για να περιγράψει όλους τους παράγοντες που οδηγούν σε μη βέλτιστα αποτελέσματα PCR. Με αυστηρά βιοχημική έννοια, η αναστολή περιορίζεται στη δραστικότητα του ενζύμου, δηλαδή μειώνει ή αποτρέπει τη μετατροπή υποστρώματος-προϊόντος μέσω αλληλεπίδρασης με την ενεργό θέση της DNA πολυμεράσης ή του συμπαράγοντά της (π.χ., Mg2+ για την Taq DNA πολυμεράση).
Συστατικά στο δείγμα ή διάφορα ρυθμιστικά διαλύματα και εκχυλίσματα που περιέχουν αντιδραστήρια μπορούν να αναστείλουν άμεσα το ένζυμο ή να παγιδεύσουν τους συμπαράγοντές του (π.χ. EDTA), απενεργοποιώντας έτσι την πολυμεράση και με τη σειρά της οδηγώντας σε μειωμένα ή ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα PCR.
Ωστόσο, πολλές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των συστατικών της αντίδρασης και των νουκλεϊκών οξέων που περιέχουν στόχο χαρακτηρίζονται επίσης ως «αναστολείς PCR». Μόλις η ακεραιότητα του κυττάρου διαταραχθεί με την απομόνωση και το νουκλεϊκό οξύ απελευθερωθεί, μπορούν να συμβούν αλληλεπιδράσεις μεταξύ του δείγματος και του περιβάλλοντος διαλύματος και της στερεάς φάσης. Για παράδειγμα, οι «καθαριστές» μπορούν να συνδεθούν με μονοκλωνικό ή δίκλωνο DNA μέσω μη ομοιοπολικών αλληλεπιδράσεων και να επηρεάσουν την απομόνωση και τον καθαρισμό μειώνοντας τον αριθμό των στόχων που τελικά φτάνουν στο δοχείο αντίδρασης PCR.
Γενικά, οι αναστολείς PCR υπάρχουν στα περισσότερα σωματικά υγρά και αντιδραστήρια που χρησιμοποιούνται για κλινικές διαγνωστικές εξετάσεις (ουρία στα ούρα, αιμοσφαιρίνη και ηπαρίνη στο αίμα), συμπληρώματα διατροφής (οργανικά συστατικά, γλυκογόνο, λίπος, ιόντα Ca2+) και συστατικά του περιβάλλοντος (φαινόλες, βαρέα μέταλλα).

Πιο διαδεδομένοι αναστολείς PCR μπορούν να βρεθούν σε βακτήρια και ευκαρυωτικά κύτταρα, μη στοχευόμενο DNA, μακρομόρια που συνδέονται με DNA σε μήτρες ιστών και εργαστηριακό εξοπλισμό όπως γάντια και πλαστικά. Ο καθαρισμός των νουκλεϊκών οξέων κατά τη διάρκεια ή μετά την εκχύλιση είναι η προτιμώμενη μέθοδος για την απομάκρυνση των αναστολέων PCR.
Σήμερα, διάφορος αυτοματοποιημένος εξοπλισμός εξαγωγής μπορεί να αντικαταστήσει πολλά χειροκίνητα πρωτόκολλα, αλλά η 100% ανάκτηση ή/και ο καθαρισμός των στόχων δεν έχει επιτευχθεί ποτέ. Πιθανοί αναστολείς μπορεί να εξακολουθούν να υπάρχουν στα καθαρισμένα νουκλεϊκά οξέα ή να έχουν ήδη τεθεί σε ισχύ. Υπάρχουν διαφορετικές στρατηγικές για τη μείωση της επίδρασης των αναστολέων. Η επιλογή της κατάλληλης πολυμεράσης μπορεί να έχει σημαντικό αντίκτυπο στη δραστικότητα του αναστολέα. Άλλες αποδεδειγμένες μέθοδοι για τη μείωση της αναστολής της PCR είναι η αύξηση της συγκέντρωσης της πολυμεράσης ή η εφαρμογή προσθέτων όπως η BSA.
Η αναστολή των αντιδράσεων PCR μπορεί να αποδειχθεί με τη χρήση εσωτερικού ελέγχου ποιότητας διεργασίας (IPC).
Πρέπει να λαμβάνεται μέριμνα για την αφαίρεση όλων των αντιδραστηρίων και άλλων διαλυμάτων στο κιτ εκχύλισης, όπως αιθανόλη, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, ισοπροπανόλη και φαινόλη, από το απομονωμένο νουκλεϊκό οξύ με ένα σχολαστικό βήμα πλύσης. Ανάλογα με τη συγκέντρωσή τους, ενδέχεται να ενεργοποιήσουν ή να αναστείλουν την PCR.