Παράγοντες παρεμβολής σε αντιδράσεις PCR

Κατά τη διάρκεια της αντίδρασης PCR, συχνά συναντώνται ορισμένοι παράγοντες παρεμβολής.
Λόγω της πολύ υψηλής ευαισθησίας της PCR, η μόλυνση θεωρείται ένας από τους σημαντικότερους παράγοντες που επηρεάζουν τα αποτελέσματα PCR και μπορούν να παράγουν ψευδώς θετικά αποτελέσματα.
Εξίσου κρίσιμες είναι οι διάφορες πηγές που οδηγούν σε ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα. Εάν ένα ή περισσότερα βασικά τμήματα του μίγματος PCR ή της ίδιας της αντίδρασης ενίσχυσης παρεμποδίζονται ή παρεμποδίζονται, η διαγνωστική δοκιμασία μπορεί να παρεμποδιστεί. Αυτό μπορεί να οδηγήσει σε μειωμένη απόδοση και ακόμη και ψευδή αρνητικά αποτελέσματα.
Εκτός από την αναστολή, μπορεί να εμφανιστεί απώλεια ακεραιότητας στόχου νουκλεϊκού οξέος λόγω των συνθηκών αποστολής ή/και αποθήκευσης πριν από την προετοιμασία του δείγματος. Συγκεκριμένα, οι υψηλές θερμοκρασίες ή η ανεπαρκής αποθήκευση μπορεί να οδηγήσουν σε βλάβη κυττάρων και νουκλεϊνικών οξέων. Η σταθεροποίηση των κυττάρων και των ιστών και η ενσωμάτωση παραφίνης είναι γνωστές αιτίες του κατακερματισμού του DNA και ένα επίμονο πρόβλημα (βλ. Σχήματα 1 και 2). Σε αυτές τις περιπτώσεις, ακόμη και η βέλτιστη απομόνωση και ο καθαρισμός δεν θα βοηθήσουν.

Εικόνα 1 | Επίδραση της ακινητοποίησης στην ακεραιότητα του DNA
Η ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης έδειξε ότι η ποιότητα του DNA που απομονώθηκε από τμήματα παραφίνης των αυτοψιών ποικίλλει σημαντικά. Το DNA διαφορετικών μέσων μηκών θραυσμάτων υπήρχε στα εκχυλίσματα ανάλογα με τη μέθοδο στερέωσης. Το DNA διατηρήθηκε μόνο όταν σταθεροποιήθηκε σε εγγενή κατεψυγμένα δείγματα και σε ρυθμισμένη ουδέτερη φορμαλίνη. Η χρήση μιας έντονα όξινης φορμαλίνης που περιείχε το όξινο όξινο είναι η φορμαλίνη που περιέχει μυρμηκικό οξύ οδήγησε σε σημαντική απώλεια του DNA. Το υπόλοιπο κλάσμα είναι εξαιρετικά κατακερματισμένο.
Στα αριστερά, το μήκος των θραυσμάτων εκφράζεται σε ζεύγη Kilobase (KBP)

Εικόνα 2 | Απώλεια ακεραιότητας στόχων νουκλεϊκού οξέος
(α) Ένα κενό 3'-5 'και στις δύο κλώνες θα οδηγήσει σε ένα διάλειμμα στο DNA στόχο. Η σύνθεση του DNA θα εξακολουθεί να εμφανίζεται στο μικρό θραύσμα. Ωστόσο, εάν λείπει ένας χώρος ανόπτησης εκκινητή στο θραύσμα DNA, εμφανίζεται μόνο γραμμική ενίσχυση. Στην πιο ευνοϊκή περίπτωση, τα θραύσματα μπορούν να μεταβληθούν μεταξύ τους, αλλά οι αποδόσεις θα είναι μικρές και κάτω από τα επίπεδα ανίχνευσης.
(β) Η απώλεια βάσεων, κυρίως λόγω της αποκατάστασης και του σχηματισμού διμερών θυμιδίνης, οδηγεί σε μείωση του αριθμού των δεσμών Η και σε μείωση του TM. Κατά τη διάρκεια της επιμήκης φάσης θέρμανσης, οι εκκινητές θα λιώσουν μακριά από το DNA της μήτρας και δεν θα ανόπτηση ακόμη και κάτω από λιγότερο αυστηρές συνθήκες.
(γ) Οι γειτονικές βάσεις θυμίνης σχηματίζουν ένα διμερές ΤΤ.
Ένα άλλο κοινό πρόβλημα που εμφανίζεται συχνά στη μοριακή διάγνωση είναι η λιγότερο από την βέλτιστη απελευθέρωση των νουκλεϊνικών οξέων στόχου σε σύγκριση με την εκχύλιση φαινόλης-χλωροφορμικής. Σε ακραίες περιπτώσεις, αυτό μπορεί να συσχετιστεί με ψευδή αρνητικά. Πολύ χρόνο μπορεί να αποθηκευτεί με βραστή λύση ή ενζυματική πέψη κυτταρικών συντριμμιών, αλλά αυτή η μέθοδος συχνά οδηγεί σε χαμηλή ευαισθησία PCR λόγω ανεπαρκούς απελευθέρωσης νουκλεϊκού οξέος.

Αναστολή της δραστικότητας πολυμεράσης κατά τη διάρκεια της ενίσχυσης

Γενικά, η αναστολή χρησιμοποιείται ως έννοια του δοχείου για να περιγράψει όλους τους παράγοντες που οδηγούν σε υποβέλτιστα αποτελέσματα PCR. Σε μια αυστηρά βιοχημική έννοια, η αναστολή περιορίζεται στη δραστικότητα του ενζύμου, δηλαδή μειώνει ή εμποδίζει τη μετατροπή του υποστρώματος-προϊόντος μέσω αλληλεπίδρασης με την ενεργό θέση της πολυμεράσης ϋΝΑ ή του συμπαράγοντα της (π.χ. Mg2+ για πολυμεράση Taq DNA).
Τα συστατικά του δείγματος ή διάφορα ρυθμιστικά και εκχυλίσματα που περιέχουν αντιδραστήρια μπορούν να αναστέλλουν άμεσα το ένζυμο ή να παγιδεύσουν τους συμπαράγοντες (π.χ. EDTA), απενεργοποιώντας έτσι την πολυμεράση και με τη σειρά τους οδηγώντας σε μειωμένα ή ψευδή αρνητικά αποτελέσματα PCR.
Ωστόσο, πολλές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των συστατικών αντίδρασης και των νουκλεϊνικών οξέων που περιέχουν στόχο χαρακτηρίζονται επίσης ως «αναστολείς PCR». Μόλις η ακεραιότητα του κυττάρου διαταραχθεί από την απομόνωση και το νουκλεϊνικό οξύ απελευθερώνεται, μπορούν να εμφανιστούν αλληλεπιδράσεις μεταξύ του δείγματος και του γύρω διαλύματος και στερεάς φάσης. Για παράδειγμα, οι «σαρωτές» μπορούν να δεσμεύσουν το DNA ενός ή διπλού κλώνου μέσω μη ομοιοπολικών αλληλεπιδράσεων και να παρεμβαίνουν στην απομόνωση και τον καθαρισμό μειώνοντας τον αριθμό των στόχων που τελικά φθάνουν στο δοχείο αντίδρασης PCR.
Γενικά, οι αναστολείς PCR υπάρχουν στα περισσότερα σωματικά υγρά και αντιδραστήρια που χρησιμοποιούνται για κλινικές διαγνωστικές δοκιμές (ουρία σε ούρα, αιμοσφαιρίνη και ηπαρίνη στο αίμα), συμπληρώματα διατροφής (οργανικά συστατικά, γλυκογόνο, λίπος, ιόντα Ca2+) και συστατικά στο περιβάλλον (φαινόμενα, βαριά μέταλλα)

Πιο διαδεδομένοι αναστολείς PCR μπορούν να βρεθούν σε βακτηρίδια και ευκαρυωτικά κύτταρα, μη στόχο DNA, μακρομόρια δέσμευσης DNA των πλεγμάτων ιστών και εργαστηριακού εξοπλισμού όπως γάντια και πλαστικά. Ο καθαρισμός των νουκλεϊνικών οξέων κατά τη διάρκεια ή μετά την εκχύλιση είναι η προτιμώμενη μέθοδος για την αφαίρεση των αναστολέων PCR.
Σήμερα, διάφοροι αυτοματοποιημένοι εξοπλισμοί εξαγωγής μπορούν να αντικαταστήσουν πολλά χειροκίνητα πρωτόκολλα, αλλά δεν έχει επιτευχθεί ποτέ 100% ανάκτηση και/ή καθαρισμός στόχων. Οι δυνητικοί αναστολείς ενδέχεται να εξακολουθούν να υπάρχουν στα καθαρισμένα νουκλεϊνικά οξέα ή ενδέχεται να έχουν ήδη τεθεί σε ισχύ. Υπάρχουν διαφορετικές στρατηγικές για τη μείωση του αντίκτυπου των αναστολέων. Η επιλογή της κατάλληλης πολυμεράσης μπορεί να έχει σημαντικό αντίκτυπο στη δραστικότητα του αναστολέα. Άλλες αποδεδειγμένες μεθόδους για τη μείωση της αναστολής PCR είναι η αύξηση της συγκέντρωσης πολυμεράσης ή η εφαρμογή πρόσθετων όπως το BSA.
Η αναστολή των αντιδράσεων PCR μπορεί να αποδειχθεί με τη χρήση του εσωτερικού ελέγχου ποιότητας της διαδικασίας (IPC).
Πρέπει να ληφθεί μέριμνα για την απομάκρυνση όλων των αντιδραστηρίων και άλλων λύσεων στο κιτ εξαγωγής, όπως η αιθανόλη, η EDTA, η CETAB, η LICL, η GUSCN, η SDS, η ισοπροπανόλη και η φαινόλη, από το απομονωμένο νουκλεϊνικό οξύ με ένα πλήρες στάδιο πλύσης. Ανάλογα με τη συγκέντρωσή τους, μπορούν να ενεργοποιήσουν ή να αναστέλλουν την PCR.