Παράγοντες παρεμβολής στις αντιδράσεις PCR

Κατά τη διάρκεια της αντίδρασης PCR, συχνά συναντώνται ορισμένοι παράγοντες παρεμβολής.
Λόγω της πολύ υψηλής ευαισθησίας της PCR, η μόλυνση θεωρείται ένας από τους σημαντικότερους παράγοντες που επηρεάζουν τα αποτελέσματα της PCR και μπορεί να παράγει ψευδώς θετικά αποτελέσματα.
Εξίσου κρίσιμες είναι οι διάφορες πηγές που οδηγούν σε ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα. Εάν ένα ή περισσότερα βασικά μέρη του μείγματος PCR ή η ίδια η αντίδραση ενίσχυσης αναστέλλονται ή παρεμποδίζονται, η διαγνωστική δοκιμασία μπορεί να παρεμποδιστεί. Αυτό μπορεί να οδηγήσει σε μειωμένη αποτελεσματικότητα και ακόμη και ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα.
Εκτός από την αναστολή, μπορεί να συμβεί απώλεια της ακεραιότητας του νουκλεϊκού οξέος στόχου λόγω των συνθηκών αποστολής και/ή αποθήκευσης πριν από την προετοιμασία του δείγματος. Ειδικότερα, οι υψηλές θερμοκρασίες ή η ανεπαρκής αποθήκευση μπορεί να οδηγήσει σε βλάβη των κυττάρων και των νουκλεϊκών οξέων. Η στερέωση κυττάρων και ιστών και η ενσωμάτωση παραφίνης είναι πολύ γνωστές αιτίες κατακερματισμού του DNA και ένα επίμονο πρόβλημα (βλ. Σχήματα 1 και 2). Σε αυτές τις περιπτώσεις, ακόμη και η βέλτιστη απομόνωση και καθαρισμός δεν θα βοηθήσει.

Εικόνα 1 | Επίδραση της ακινητοποίησης στην ακεραιότητα του DNA
Η ηλεκτροφόρηση γέλης αγαρόζης έδειξε ότι η ποιότητα του DNA που απομονώθηκε από τομές παραφίνης των αυτοψιών διέφερε σημαντικά. DNA διαφορετικών μέσων μηκών θραυσμάτων υπήρχε στα εκχυλίσματα ανάλογα με τη μέθοδο στερέωσης. Το DNA διατηρήθηκε μόνο όταν σταθεροποιήθηκε σε φυσικά κατεψυγμένα δείγματα και σε ουδέτερη φορμαλίνη με ρυθμιστικό διάλυμα. Η χρήση ενός ισχυρά όξινου σταθεροποιητικού Bouin ή χωρίς ρυθμιστικό διάλυμα φορμαλίνης που περιέχει μυρμηκικό οξύ είχε ως αποτέλεσμα σημαντική απώλεια DNA. Το υπόλοιπο κλάσμα είναι πολύ κατακερματισμένο.
Στα αριστερά, το μήκος των θραυσμάτων εκφράζεται σε ζεύγη κιλοβάσης (kbp)

Εικόνα 2 | Απώλεια ακεραιότητας στόχων νουκλεϊκού οξέος
(α) Ένα κενό 3'-5' και στους δύο κλώνους θα οδηγήσει σε θραύση στο DNA στόχο. η σύνθεση του DNA θα εξακολουθεί να συμβαίνει στο μικρό θραύσμα. Ωστόσο, εάν λείπει μια θέση ανόπτησης εκκινητών στο θραύσμα DNA, λαμβάνει χώρα μόνο γραμμική ενίσχυση. Στην πιο ευνοϊκή περίπτωση, τα θραύσματα μπορεί να ξανακορεσθούν μεταξύ τους, αλλά οι αποδόσεις θα είναι μικρές και κάτω από τα επίπεδα ανίχνευσης.
(β) Η απώλεια βάσεων, κυρίως λόγω αποπουρίνωσης και σχηματισμού διμερούς θυμιδίνης, οδηγεί σε μείωση του αριθμού των δεσμών Η και σε μείωση του Tm. Κατά τη διάρκεια της επιμήκους φάσης θέρμανσης, οι εκκινητές θα λιώσουν μακριά από το DNA της μήτρας και δεν θα ανόπτονται ακόμη και κάτω από λιγότερο αυστηρές συνθήκες.
(γ) Παρακείμενες βάσεις θυμίνης σχηματίζουν ένα διμερές ΤΤ.
Ένα άλλο κοινό πρόβλημα που εμφανίζεται συχνά στη μοριακή διάγνωση είναι η λιγότερο από τη βέλτιστη απελευθέρωση νουκλεϊκών οξέων-στόχων σε σύγκριση με την εκχύλιση φαινόλης-χλωροφορμίου. Σε ακραίες περιπτώσεις, αυτό μπορεί να συσχετιστεί με ψευδώς αρνητικά. Μπορεί να εξοικονομηθεί πολύς χρόνος με τη λύση βρασμού ή την ενζυματική πέψη των κυτταρικών υπολειμμάτων, αλλά αυτή η μέθοδος συχνά οδηγεί σε χαμηλή ευαισθησία PCR λόγω ανεπαρκούς απελευθέρωσης νουκλεϊκού οξέος.

Αναστολή της δραστηριότητας πολυμεράσης κατά την ενίσχυση

Γενικά, η αναστολή χρησιμοποιείται ως έννοια του περιέκτη για να περιγράψει όλους τους παράγοντες που οδηγούν σε μη βέλτιστα αποτελέσματα PCR. Με αυστηρά βιοχημική έννοια, η αναστολή περιορίζεται στη δραστηριότητα του ενζύμου, δηλαδή μειώνει ή αποτρέπει τη μετατροπή υποστρώματος-προϊόντος μέσω αλληλεπίδρασης με την ενεργή θέση της DNA πολυμεράσης ή του συμπαράγοντά της (π.χ. Mg2+ για την Taq DNA πολυμεράση).
Συστατικά στο δείγμα ή διάφορα ρυθμιστικά διαλύματα και εκχυλίσματα που περιέχουν αντιδραστήρια μπορούν να αναστείλουν άμεσα το ένζυμο ή να παγιδεύσουν τους συμπαράγοντες του (π.χ. EDTA), αδρανοποιώντας έτσι την πολυμεράση και με τη σειρά τους οδηγώντας σε μειωμένα ή ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα PCR.
Ωστόσο, πολλές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των συστατικών της αντίδρασης και των νουκλεϊκών οξέων που περιέχουν στόχο χαρακτηρίζονται επίσης ως «αναστολείς PCR». Μόλις διαταραχθεί η ακεραιότητα του κυττάρου από την απομόνωση και απελευθερωθεί το νουκλεϊκό οξύ, μπορεί να προκύψουν αλληλεπιδράσεις μεταξύ του δείγματος και του περιβάλλοντος του διαλύματος και της στερεάς φάσης. Για παράδειγμα, οι «καθαριστές» μπορούν να δεσμεύσουν μονόκλωνο ή δίκλωνο DNA μέσω μη ομοιοπολικών αλληλεπιδράσεων και να παρεμποδίσουν την απομόνωση και τον καθαρισμό μειώνοντας τον αριθμό των στόχων που τελικά φτάνουν στο δοχείο αντίδρασης PCR.
Γενικά, οι αναστολείς PCR υπάρχουν στα περισσότερα σωματικά υγρά και αντιδραστήρια που χρησιμοποιούνται για κλινικές διαγνωστικές εξετάσεις (ουρία στα ούρα, αιμοσφαιρίνη και ηπαρίνη στο αίμα), συμπληρώματα διατροφής (οργανικά συστατικά, γλυκογόνο, λίπος, ιόντα Ca2+) και συστατικά στο περιβάλλον (φαινόλες βαρέα μέταλλα)

Οι πιο διαδεδομένοι αναστολείς PCR μπορούν να βρεθούν σε βακτήρια και ευκαρυωτικά κύτταρα, σε μη-στόχο DNA, σε μακρομόρια ιστών που δεσμεύουν το DNA και σε εργαστηριακό εξοπλισμό, όπως γάντια και πλαστικά. Ο καθαρισμός των νουκλεϊκών οξέων κατά τη διάρκεια ή μετά την εκχύλιση είναι η προτιμώμενη μέθοδος για την απομάκρυνση των αναστολέων PCR.
Σήμερα, διάφορος εξοπλισμός αυτοματοποιημένης εξαγωγής μπορεί να αντικαταστήσει πολλά χειροκίνητα πρωτόκολλα, αλλά ποτέ δεν επιτεύχθηκε 100% ανάκτηση ή/και καθαρισμός των στόχων. Πιθανοί αναστολείς μπορεί να εξακολουθούν να υπάρχουν στα καθαρισμένα νουκλεϊκά οξέα ή μπορεί να έχουν ήδη δράσει. Υπάρχουν διαφορετικές στρατηγικές για τη μείωση της επίδρασης των αναστολέων. Η επιλογή της κατάλληλης πολυμεράσης μπορεί να έχει σημαντικό αντίκτυπο στη δραστηριότητα του αναστολέα. Άλλες αποδεδειγμένες μέθοδοι για τη μείωση της αναστολής της PCR είναι η αύξηση της συγκέντρωσης πολυμεράσης ή η εφαρμογή προσθέτων όπως το BSA.
Η αναστολή των αντιδράσεων PCR μπορεί να αποδειχθεί με τη χρήση εσωτερικού ελέγχου ποιότητας διεργασίας (IPC).
Πρέπει να ληφθεί μέριμνα ώστε να αφαιρεθούν όλα τα αντιδραστήρια και άλλα διαλύματα στο κιτ εκχύλισης, όπως η αιθανόλη, το EDTA, το CETAB, το LiCl, το GuSCN, το SDS, η ισοπροπανόλη και η φαινόλη, από το προϊόν απομόνωσης νουκλεϊκού οξέος με ένα βήμα σχολαστικής πλύσης. Ανάλογα με τη συγκέντρωσή τους, μπορεί να ενεργοποιήσουν ή να αναστείλουν την PCR.